課 題 名 稱：
大黃煎劑干預治療輕微型肝性腦病的機理研究
一、選題的目的意義與立題依據(包括國內外進展情況)：
通過中醫辨證論治，採用中醫通腑開竅法的大黃煎劑保留灌腸對mhe干預作用影響研究，觀察mhe患者用藥干預前後的心理智力測驗(dst、sdt)、生存質量檢測以及肝功能、乙肝病毒-dna、肝纖四項、血清細胞因子(白細胞介素-2、腫瘤壞死因子、白細胞介素6、白細胞介素8)的含量及tgf-b1活性、巨噬細胞吞噬功能及肝臟組織病理等變化規律，分析數據相關性，評價大黃煎劑對mhe的干預作用，揭示其作用機理，為大黃煎劑有效臨牀實踐提供新的科學依據，為mhe診斷和防治研究拓寬思路。
輕微型肝性腦病(minimal hepatic encephalopathy, mhe) 過去被稱為亞臨牀型肝性腦病( subclinical he, she)，是指某些慢性肝病患者無明顯相關症狀和生化異常，但用精細的智力試驗或神經電生理檢查可見智力、神經、精神的異常而診斷的肝性腦病[1] (hepatic encephalopathy，he)。患者雖形似正常，但操作能力和應急反應能力減低，在從事高空作業、機械或駕駛等工作時容易發生意外。由於“亞臨牀”這個詞有一定的誤導性，易被誤認為mhe 發病機制獨立於he 之外，或臨牀意義不大，1998 年第11 屆世界胃腸大會就肝性腦病的定義、命名、診斷和定量標準進行修訂將she 更名為mhe[2]，以強調其作為he 發展過程中的一個特殊階段。據報道，國內1991 ～XX 年肝硬化患者mhe 發病率在38.8% ～85.0%[3]，國外為30% ～84%[4]，部分mhe 患者如不進行有效治療將會發展為臨牀型肝性腦病。一旦發生臨牀型肝性腦病，病死率高達50%。廣西是全國病毒性肝炎的高發地區之一，全區肝性腦病發病率及死亡率均高於全國平均水平。本課題針對廣西的常見多發重大疾病，充分發揮傳統中醫藥的優勢，深入開展科學研究，早期干預，既病防變，為早期防治肝性腦病提供有效治療手段。開拓中醫肝病治未病臨牀路徑。為防治廣西常見多發重大疾病提供高效廉價的預防診療康復等臨牀途徑，降低社會和家庭的經濟負擔，為廣西經濟發展、社會穩定作出貢獻。
mhe的病理學變化多是繼發性，其發生機理與腦功能失調和代謝功能障礙密切相關。目前對其發病機制的認識主要有氨中毒學説、γ-氨基丁酸(gamma-aminobutyricacid，gaba)學説、假性神經遞質學説及血漿氨基酸失衡學説等，但依據這些學説尚不能完善解釋mhe心理認知功能障礙的發生過程。中醫學在mhe防治中具有身心整體論治優勢，中藥複方具有多層次、多靶位點的藥理學作用，因此，充分發揮中醫複方的作用優勢，已成為mhe防治研究的新亮點。我們認為，mhe的中醫關鍵病理因素為“痰、瘀、毒”互結，以致“腑氣不通，腦竅矇蔽”。採用通腑開竅之法，可將腸道內毒濁之氣排除體外，以達開竅醒神之效。大黃煎劑由大黃和烏梅組成(大黃30g、烏梅30g)，方中大黃具有瀉下利膽退黃、清熱解毒化瘀之功;烏梅具有收斂生津殺蟲的功效。兩藥合用，具有祛痰、化瘀、解毒之效，是通腑化瘀法的代表方劑。通過臨牀研究證實，大黃煎劑保留灌腸具有促醒、保肝護肝及減“毒”增效的作用，此方在臨牀應用十餘年，經臨牀診治有效者逾500例[5-7]。實驗研究表明，該方除了具有抑制腸道內細菌成長、降低腸道內ph值、阻止腸道內nh3的吸收及保護肝細胞線粒體的結構和功能外[8]，還具有加強肝臟巨噬細胞的活力、提高tgf-b1的活性、改善肝臟纖維化程度及對血清細胞因子的影響、提高機體免疫力、幫助機體清除肝炎病毒的作用[9-11]。由此可見，大黃煎劑具有防治輕微型肝性腦病作用功效。且大黃煎劑起效快、安全性高、技術操作簡易、藥物來源豐富、適用範圍廣等優點，適宜推廣應用。但本方的作用機制尚未完全闡明，有待進一步研究。本課題在中醫治未病“既病防變”理論指導下，探討mhe認知功能變化及其機理，對進一步豐富mhe的發病機制，及從其認知功能變化切入，探討mhe中醫早期診斷、早期干預的治療方法，有助於開拓mhe臨牀治療新途徑。對 mhe診治的有效率再提高，對構建一個可實用推廣的中醫肝病治未病臨牀途徑都具有重要意義。
經查新，目前對大黃煎劑干預治療 mhe的作用機理研究報導的文獻很少，本課題基於大黃煎劑對肝性腦病干預作用的研究基礎，以及近年來中西醫輕微型肝性腦病治療研究前沿成果，提出工作假説：在中醫治未病“既病防變”理論指導下，以通腑開竅法立論的大黃煎劑對mhe的認知功能損害具有改善作用，其機制可能與改變血清細胞因子含量、改變肝臟巨噬細胞吞噬功能以及tgf-b1活性、改善肝組織纖維化程度有關。圍繞假説，擬採用p300電位、數字連接實驗等測評工具，檢測mhe認知功能變化，放射免疫法檢測血清細胞因子含量(白細胞介素-2、腫瘤壞死因子、白細胞介素8、白細胞介素6)，用酶聯免疫吸附法檢測肝巨噬細胞活力、tgf-b1活性變化，並用蘇木青--伊紅染色檢測炎性分度、網狀纖維染色測定肝纖維化的分級等觀測中醫藥對mhe的干預作用，從免疫組學、病理學等多學科多角度揭示大黃煎劑干預治療輕微型肝性腦病的作用機理。早期干預，既病防變，為肝性腦病早期防治提供有效治療手段。構建一條可使用推廣的中醫肝病治未病臨牀路徑。
參考文獻：
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二、主要研究內容、臨牀或實驗設計、主要技術路線和預期結果：
1、主要研究內容：通過觀察輕微型肝性腦病認知功能變化與血清細胞因子含量及巨噬細胞的活力、tgf-b1活性之間的關係，分析大黃煎劑的干預機制，揭示中醫藥治未病“既病防變”，防止疾病向肝性腦病進一步發展的干預作用。
1.1 通過心理智能檢測——數字連接實驗(nct)觀察輕微型肝性腦病認知功能變化及大黃煎劑對mhe的影響。
1.2從血清細胞因子(白細胞介素-2、白細胞介素6、白細胞介素8、腫瘤壞死因子等)的含量及肝巨噬細胞活力、tgf-b1活性的變化觀察大黃煎劑的干預作用
採用統計學相關性分析技術，分析輕微型肝性腦病患者治療前後的認知功能變化與血清細胞因子含量及肝巨噬細胞活力、tgf-b1活性變化的相關性，闡明解大黃煎劑對輕微型肝性腦病認知功能的影響及其干預機制。
1.3生存質量的檢測觀察大黃煎劑的干預作用
生存質量測定量表簡表(whoqol—bref)中國版,它覆蓋了生理、心理、社會關係、環境4個領域，共26個條目。從患者生理領域、心理領域、社會關係領域來觀察大黃煎劑對患者生活質量的明顯改善。
2、臨牀設計及主要技術路線：
2.1試驗方法：
採用多中央隨機、雙盲、多中心臨牀研究方法，選擇既符合西醫診斷又符合中醫症候診斷納入標準mhe患者60例作為受試者，隨機分為試驗組、對照組和安慰劑3組，比例為1:1:1，予以相應藥物灌腸治療，a組(大黃煎劑組) 、b組(乳果糖組) 、c組(安慰劑組) ，每組各20例。試驗週期7天，試驗前後進行認知功能檢測、血清細胞因子含量及肝巨噬細胞活力、tgf-b1活性檢測。停藥後7天，15天各隨訪一次，行智力檢測(nct、sdt)，生存質量檢測，相關的理化檢查(肝、腎功能及hbv-dna等)。病例來源：廣西中醫學院第一、二附屬醫院(均為國家三級甲等醫院)。
(1)隨機方法：採用中心區組隨機方法。通過spss11.0軟件產生60例受試者所接受處理的隨機號。設種子數為任意6位數，區組長度為6，按1:1:1比例隨機分為試驗組、對照組、安慰劑組，盲底產生後，
確定受試者組別，取得相應的藥物號。
(2)盲法設定：使用雙盲技術，藥物採用相同外觀包裝，按隨機數字進行編盲。
2.1.1研究對象的選擇：
(1)西醫診斷標準：
①肝硬化患者診斷標準
肝硬化診斷符合中國中西醫結合學會消化系統疾病專業委員會於1993年11月在洛陽召開第五屆學術交流會上制定的肝硬化臨牀診斷標準(試行方案) child (child-pugh)評分分級，符合 a級與b級患者，且排除mhe患者。
②mhe患者診斷標準
a、肝硬化診斷均符合肝炎後肝硬化診斷標準肝硬化child - pugh分級均為 a、b級
b、腦誘發電位和數字連接試驗(number connection test, nct)及數字符合試驗(symbol digittest, sdt)同時或其中一項異常者
(2)中醫診斷標準：
參考國家藥品食品監督管理局《中藥新藥臨牀研究指導原則》(XX年)中的《中醫證候的臨牀研究指導原則》及中華人民共和國國家標準《中醫臨牀診療術語-證候部分》gb/t16751.2-1997。選擇如下：
痰熱內擾，氣滯血瘀證。
主症：心煩，失眠，多夢，健忘，便祕。
次症：頭暈、胸脅脘腹脹悶竄痛，偶有刺痛，或脅下痞塊、發熱口渴，吐痰色黃，或喉間痰鳴，尿黃。舌暗紅或有斑點，苔黃膩，脈弦澀。
注：符合兩個主症+舌象或符合一個主症+兩個次症或脈象+舌象。
(3)入選標準：
①符合mhe患者診斷標準
②符合中醫證型診斷標準
③年齡18-65歲：性別不限
④獲取知情同意，志願受試
(4)排除標準：
①過去或現在有肝性腦病;
②有精神心理或神經方面疾病;
③近4周內服用鎮靜劑或中樞神經系統抑制劑;
④酒精性肝硬化仍繼續酗酒者;
⑤近2周內出現消化道出血者;
⑥近2周內因使用利尿劑導致水、電解質、酸鹼平衡紊亂者;
⑦體温在37. 5℃以上者;
⑧伴隨嚴重心、肺、腦、腎疾病者;嚴重糖尿病併發症者
⑨文盲、半文盲者和不合作者。
(5)受試者剔除標準：
①入選後發現不符合診斷標準者;
②入選後沒用使用試驗藥物者;
③入選後無任何實驗數據者;
④盲態審核後不符合方案要求者
(6)受試者脱落標準和處理：
在試驗進行的過程中，當發生下述情況時，研究者有責任終止受試者繼續參加試驗，隨後對終止理由、日期及導致此事件發生的臨牀過程等在病例報告表上做出闡述和評估，受試者也可自行決定退出。
①經研究者判定，因不良事件或異常的實驗室檢測值無法繼續試驗。
②受試者自願退出試驗。
③違背方案(受試者不符合入選標準;不能遵守方案的要求;不能遵循用藥的要求，即服藥依從性小於80%或者大於120%)。
④需要使用本試驗禁忌的藥物。
⑤研究者認為不宜繼續服藥者或認為繼續試驗有困難者。
⑥受試者有權在任何時候退出試驗而不需要任何理由。
當發生脱落時，應對脱落病例進行以下處理：①當受試者脱落後，研究者應爭取登門、預約隨訪，以電話、信件等方式，儘可能與受試者聯繫，詢問原因、記錄最後一次用藥時間、完成所能完成的評估項目;②因過敏反應、不良反應、治療無效而退出研究的病例，研究者應根據實際情況，給予相應的治療措施;③填寫crf表的“試驗小結表”;④填寫crf表的“脱落原因表”;⑤凡是入選並已使用編號藥物的病人，無論是否脱落，均應記錄和保留病例報告表(crf)，即作留檔，並進行意向性分析。
(7)中止實驗標準和處理：
發生以下情況之一即中止觀察：
①觀察對象試驗期間病情惡化，有可能發生危險事件，研究者認為應該停止臨牀試驗者;
②發生與藥物有關的嚴重不良事件。
對病情惡化患者應及時採取相應的治療措施。對觀察對象退出觀察的原因應記錄在crf表中，如有可能，觀察對象應按計劃在觀察結束時進行必要檢查。提前終止或退出的觀察對象，中止前需做最後一次隨訪對病情加以評估，並填表，保留資料備用。
(8)倫理學研究要求：
倫理委員會審查：課題研究報廣西中醫學院倫理委員會審查、批准後實施。
知情同意：嚴格按要求履行本研究《知情同意操作規範》，確保全部患者知情同意並簽署知情同意書後方可納入。
2.1.2治療方案
(1)試驗用藥
①試驗組藥物選擇：
大黃煎劑：由大黃30g，烏梅30g組成，由廣西中醫學院第一附屬醫院製劑室統一製成200ml/袋的灌腸液，要求同一批次。
②對照組藥物選擇：
乳果糖口服液：商品名杜密克，規格15ml*6包，由廣西中醫學院第一附屬醫院藥劑科統一購入，要求同一批次。
③安慰劑組藥物選擇：
注射用水：由廣西中醫學院第一附屬醫院藥劑科統一購入，要求同一批次。
(2)給藥方案
a組(試驗組方案)：
大黃煎劑(醋制大黃30g，烏梅30g)，由廣西中醫學院藥劑科統一生產，200ml/瓶灌腸液，按規範操作(如下)，保留灌腸，1次/天，7天為1個療程。
b組(對照組方案)：
乳果糖口服液45ml，乳果糖由荷蘭蘇威製藥公司生產，加入無菌蒸餾水155ml，配成22.5%乳果糖灌腸液200ml，保留灌腸。1次/天，7 天為1個療程。
c組(安慰劑組方案)：
取注射用水200ml，，保留灌腸。1次/天，7 天為1個療程。
保留灌腸規範化操作流程：所用灌腸液應用前均加温至40℃，用50ml 甘油注射器抽取，連接14 號肛管，患者取左側卧位，將肛管輕柔插入直腸30cm以上，緩慢注入藥液。拔管後用手掐住臀部向肛門擠壓，壓迫肛門括約肌5min，在操作完畢後，患者轉為右側卧位，使藥物在腸內儘量保持120分鐘以上。
2.1.3觀察指標
①智力測驗：採用nct試驗及sdt試驗。
②生存質量：採用who生存質量測定量表簡表(whoqol-bref)中國版。
④免疫組學、病理學指標：血清細胞因子(白細胞介素-2、腫瘤壞死因子、白細胞介素6、白細胞介素8)的含量及tgf-b1活性、巨噬細胞吞噬功能及肝臟組織纖維化程度。
⑤ 安全性指標
a 谷丙轉氨酶(alt)、總膽紅素(tbil)、白蛋白，乙肝病毒-dna，肝纖四項，腎功能(尿素氮、肌酐)。
b 血常規;尿常規;糞常規及潛血。
c 心電圖。
d 不良事件和不良反應。
2.1.4統計學方法
計量資料用均數±標準差( )表示，記數資料用百分數表示。干預治療前的計量資料比較用單因素方差分析，干預治療後的計量資料比較用雙因素方差分析，計數資料比較用χ2檢驗。全部資料用spss17.0 for windows統計。
2.2主要技術路線圖：
符合納入標準的mhe患者
a組(大黃煎劑)
b組(乳果糖)
c組(安慰劑)
藥效學研究
認知功能障礙檢測
免疫學、病理學檢測
隨機分組盲法對照
放射免疫法、elisa法、蘇木青-伊紅染色法檢測血清細胞因子含量、肝巨噬細胞活力、tgf-b1活性及肝纖維化分級
數字連接試驗
數字符合試驗
who生存質量測定量表簡表
安全評估肝功能腎功能hbv-dna三大常規心電圖不良事件和不良反應等
定期隨訪：相 生 心應 存 理理 質 智化 量 力檢 測 測查 試 試; ; 。
大黃煎劑干預治療輕微型肝性腦病的機理研究
三、時間安排：
實施階段時 間目標內容
第一階段XX年05月至XX年06月藥物、試劑準備及實驗準備
第二階段XX年07月至XX年09月預實驗及預實驗總結
第三階段XX年10月至XX年01月病例收集，完成設計的各項指標的觀察與檢測
第四階段XX年02月至XX年04月病例隨訪;資料整理，數據統計分析，撰寫論文，結題及成果鑑定
四、經費預算情況：
金額單位：(千元)
序
號
科目名稱
項目經費投入合計
計算依據與説明
1
一、經費支出
5.0
2
1.科研業務費
3.0
3
(1) 測試、計算、分析費
1.0
病例收集、測試費以及數據整理、統計分析費等
4
(2)出版、文獻檢索、信息通訊費
2.0
文獻資料複印、結果彙報、論文出版、信息通訊費等
5
2.實驗材料費
2.0
6
(1)原材料、試劑、藥品購置費
1.0
藥品,試劑盒
7
(2)標本、樣品費
0.5
樣品採集加工
8
(3)其他
0.5
量表、低值易耗品
五、現有基礎(預實驗情況、主要儀器設備等)：
導師姚春長期從事肝臟疾病的中醫藥的臨牀與實驗研究《解毒化瘀ⅱ方對肝衰竭大鼠肝細胞線粒體保護機制的研究》為國家自然科學基金項目。其研究成果通過鑑定，達國際先進水平。參與研究的項目《解毒化瘀顆粒拮抗肝衰竭的基礎研究》榮獲XX年度廣西科學技術進步三等獎。XX年項目《重型肝炎中醫辨證規範與療效評價的研究》成果鑑定達到國際先進水平,獲XX年廣西科學技術進步獎二等獎(XX-j-3-065)。XX年項目《通腑開竅法(大黃煎劑)治療肝性腦病的基礎與臨牀研究》成果鑑定達到國內先進水平，獲廣西衞生廳適宜技術推廣三等獎, XX年廣西科學技術進步獎三等獎(XX-j-3-065)。現在研究的課題輕微型肝性腦病認知功能障礙特異性代謝物譜分析及大黃煎劑的干預作用研究屬國家自然科學基金。廣西中醫學院第一附屬醫院和瑞康醫院醫學分子生物學實驗室均是國家中醫藥管理局三級實驗室，廣西中醫學院第一附屬醫院還是國家中醫藥管理局“毒濁致病與中醫重症”重點研究室。作為全區最大規模的中醫院及廣西中醫肝病治療中心具有良好的中醫藥防治肝病臨牀技術，能保證本研究的順利實施。 廣西中醫學院第一附屬醫院及瑞康醫院實驗所需儀器設備和技術均已具備。
六、可行性分析：
1. 查閲了大量與課題相關的研究資料和文獻，有豐富的知識儲備和積累。2. 本課題前期研究工作紮實，獲得了較好的研究成果。為本課題的研究提供了良好的基礎。3. 本課題已具備了中醫肝病、病理學等多學科高學歷人才，多學科結合，優勢互補。項目成員分工明確，參與及主持多項國家級、省部級科研課題，有深厚的理論基礎及較強的科研能力4. 本研究以傳統中醫理論為依據，確保研究結果科學可信，既體現了傳統中醫藥特色，又充分利用了現代醫學研究技術，具有一定的傳統中醫特色，具有一定的可行性、科學性與創新性。5. 廣西中醫學院及其附屬醫院有較強的科研能力，有充足的病源，可保證本課題病例收集工作的開展。