一、 實驗目的
1.掌握熒光光度計的基本原理及使用。
2.瞭解熒光分光光度計的構造和各組成部分的作用。
3.掌握分子熒光光度計分析物質的特徵熒光光譜：激發光譜、發射光譜的測定方法。
4.瞭解影響熒光產生的幾個主要因素。
5.學會運用分子熒光光譜法對物質進行定性和定量分析。
二、 實驗原理
原子外層電子吸收光子後，由基態躍遷到激發態，再回到較低能級或者基態時，發射出一定波長的輻射，稱為原子熒光。對於分子的能級激發態稱為分子熒光，平時所説的熒光指分子熒光。
具有不飽和基團的基態分子經光照射後，價電子躍遷產生熒光，是當電子從第一激發單重態S1的最低振動能級回到基態S0各振動能級所產生的光輻射。
(1)激發光譜
是指發光的某一譜線或譜帶的強度隨激發光波長(或頻率)變化的曲線。橫座標為激發光波長，縱座標為發光相對強度。
激發光譜反映不同波長的光激發材料產生髮光的效果。即表示發光的某一譜線或譜帶可以被什麼波長的光激發、激發的本領是高還是低；也表示用不同波長的光激發材料時，使材料發出某一波長光的效率。熒光為光致發光，合適的激發光波長需根據激發光譜確定——激發光譜是在固定熒光波長下，測量熒光體的熒光強度隨激發波長變化的光譜。獲得方法：先把第二單色器的波長固定，使測定的λem不變，改變第一單色器波長，讓不同波長的光照在熒光物質上，測定它的熒光強度，以I為縱座標，λex為橫座標所得圖譜即熒光物質的激發光譜，從曲線上找出λex，，實際上選波長較長的高波長峯。
(2)發射光譜
是指發光的能量按波長或頻率的分佈。通常實驗測量的是發光的相對能量。發射光譜中，橫座標為波長（或頻率），縱座標為發光相對強度。
發射光譜常分為帶譜和線譜，有時也會出現既有帶譜、又有線譜的情況。 發射光譜的獲得方法：先把第一單色器的波長固定，使激發的λex不變，改變第二單色器波長，讓不同波長的光掃描，測定它的發光強度，以I為縱座標，λem為橫座標得圖譜即熒光物質的發射光譜;從曲線上找出最大的λem。
(3)熒光強度與熒光物質濃度的關係
用強度為I0的入射光，照射到液池內的熒光物質時，產生熒光，熒光強度If用儀器測得，在熒光濃度很稀(A<0.05)時，熒光物質發射的熒光強度If與濃度有下面的關係：If=KC。
三、 實驗試劑和儀器
試劑：羅丹明B乙醇溶液；1-萘酚乙醇溶液；3,3’-Diethyloxadicarbocyanine iodide：標準溶液，10μg/ml, 20μg/ml,30μg/ml,40μg/ml和未知濃度；蒸餾水；乙
醇。
儀器：Fluoromax-4熒光分光光度計；1cm比色皿；spectrofluorometer分析軟件。
熒光分析儀器結構：它主要由光源、單色器、液槽、檢測器和顯示器組成。光源發出的紫外-可見或者紅外光經過激發單色器分光後，照到熒光池中的被檢測樣品上，樣品收到該激發光照射後，發出的熒光經發射單色器分光，由光電倍增管轉換成相應電信號，再經放大器放大反饋進入轉換單元，將模擬電信號轉換成相應數字信號，並通過顯示器或打印機顯示和記錄被測樣品譜圖。
四、 實驗步驟
1.樣品製備。配置不同濃度的3,3’-Diethyloxadicarbocyanine iodide溶液，分別為10μg/ml, 20μg/ml,30μg/ml,40μg/ml和未知濃度。
2.打開熒光分光光度計和電腦，預熱半個小時。
3.打開spectrofluorometer分析軟件，進行相關參數的設置。首先檢測羅丹明B的激發光譜，此時固定發射波長為560nm，檢測並保存激發光譜。然後根據所檢測的激發光譜中的最大峯值541nm來設置檢測羅丹明B的熒光光譜的激發波長，檢測並保存所得的熒光光譜。
4.檢測1-萘酚的熒光光譜。方法同步驟3。
5.用已配置好的3,3’-Diethyloxadicarbocyanine iodide標準溶液進行與2中相同的步驟，找到最大激發波長與最大發射波長，之後選定單點檢測模式，並設置成剛選擇的最大激發波長與最大發射波長，分別對10μg/ml, 20μg/ml,30μg/ml,40μg/ml進行檢測，記錄數據，繪製工作曲線。
6.對未知濃度3,3’-Diethyloxadicarbocyanine iodide進行檢測，記錄數據，並根據工作曲線求出濃度。
五、 數據記錄和處理
1． 數據記錄
(1)羅丹明B的測定
圖2.羅丹明B的激發光譜
圖3.羅丹明B的熒光光譜